将 SDS-PAGE 上的蛋白质样品从凝胶上分离出来是很困难的，目前流行的方法是将蛋白质电印迹（electrobloting） 至 PVDF 膜上，直接进行序列分析或直接在膜上进行酶解，后者称为原位分析。

1. 蛋白质样品的准备

进行序列分析的蛋白质样品，一般纯度要求大于 95％， 通常是用色谱和电泳精制过的。

1.1 SDS-PAGE 纯化的样品

从 SDS-PAGE 上分离的蛋白质必须经过特殊处理，使 SDS 浓度低于 0.0005％，否则 SDS 会影响到胰蛋白酶的酶解，也会明显降低 HPLC 分离时的分辨力。在 SDS-PAGE 后，采用电印迹 （bloting） 转移到 PVDF 膜上是常用的方法，因为 PVDF 膜结合蛋白质能力的专一性远远超过它与盐、氨基酸和去垢剂的结合，因此能将蛋白质与这些杂质分开。经过这样转移的 PVDF 膜可直接用于化学裂解或酶解后的肽段氨基酸序列分析。

1.2 HPLC 纯化的样品

如果样品是用反相 HPLC 纯化的。 因为流动相是挥发性溶剂，在真空干燥或冻干样品时可被除去。如果蛋白质是用离子交换 HPLC 或疏水 HPLC 或凝胶过滤 HPLC 精制的，则样品要进行脱盐。

1.3 蛋白质样品中的一硫键和疏基

在蛋白质样品纯度达到要求，盐和小分子也已除净时，还要转变半胱氨酸残基或其他稳定的衍生物。因为半胱氨酸的巯基在分肽过程中易自动氧化成各种产物，包括形成无序的二硫键，因此需要将半胱氨酸残基先转变成稳定的衍生物。通常用碘代乙酸烷化，这个反应是快速和专一的；同时这类试剂保存在暗处是很稳定的。而且，这类试剂容易得到放射性标记物。蛋白质或肽在导入带电荷基团后也增加了它们在水溶液中的溶解度。

2. 原位酶解和测序

2.1 将膜片剪成 1 mm 细条，放在 Eppendoff 管中；

2.2 加 1.2 ml 0.5％ PVP-40／0.1 mol／L HAC，37 ℃，保温 30 min；

2.3 用蒸馏水洗膜 5 次以上，洗净残留的 PVP-40；

2.4 用酶解缓冲液漂洗，然后进行酶解；

2.5 酶解：蛋白酶在 100 mol／L NH4HCO3：ACN＝95：5，pH 8.2，37 ℃ 酶解过夜，对 V8 蛋白酶则在 100 mmol／L 磷酸钠：ACN＝95：5，pH7.8，室温过夜。酶：底物 1：10 至 1：20（W／W），对亚微克级样品，酶：底物高达 2：1。酶解后 -20℃ 保存或立即用几微升 10％ 三氟乙酸（TFA）酸化，上样到 HPLC 柱上分析。如果蛋白质纯品的量足够多时，可采用常规的化学裂解或酶解方法得到可供进行氨基酸序列分析的肽段。

1. 磺代乙酸必须是无色的，有碘存在，呈淡黄色，会引起疏基迅速氧化，阻碍了烷化反应。

2. 微克级蛋白质的操作，实验室内的温度，灰尘，纤维，皮肤汗液和头屑等都会影响结果。

3. 容器及透析袋表面的吸附作用致使蛋白质严重损失。建议用微量透析仪器或小凝胶过滤柱脱盐。

在得到蛋白质部分氨基酸序列的基础上通常采用设计简并性或偏性引物，用锚定 PCR 的方法来获得该蛋白质的 cDNA 部分或全长序列。现在许多公司推出的 RACE（rapidly amplication cDNA ends）系统的技术核心便是如此。

简并性引物的设计一般遵循以下几个原则：

1. 具有高度特异性：根据所得到蛋白质的部分氨基酸序对，在数据库内进行检索，找出较为特异的一段作为设计引物的模板。在互联网上常用的数据库如：GenBank 的 PDB（protein data base），SwissProt 等。

2. 简并度是指每一个位置上碱基数的乘积。一般认为一条简并性引物的简并度不应大于 100。

3. 降低引物的简并度：可以用「I（次黄嘌呤碱基）」来代替，因为理论上 I 可以与任何－种碱基配对。但 I 一般应尽量远离引物的 3\' 端。而且如果 3\' 末端出现简并性的碱基，则应包括所有可能的碱基，因为 3\' 末端碱基的错配会导致 Taq 酶作用延伸反应不能进行。还有一种降低引物简并度的方法是在扩增人的基因时，可以根据偏性密码子来代替高度简并的碱基位置，即猜测（guessmer）。

4. 其他则应遵循非简并性引物的设计要求：引物长度为 19～24 个碱基，G＋C 的含量应在 40％～60％ 之间，3\' 末端的碱基最好为 G 或 C，而不要是 A、T 或 I，引物序列中应避免出现重复的互补结构等。

现在设计引物的程序及软件繁多。常用的如：Oligo 5.0、Primer2.0 等。都可以帮助快速有效的进行引物设计。简并性碱基的代表符号见表。

简并性碱基的代表符号

PCR（polymerase chain reaction）作为一种常用的分子生物学实验手段，已非常成熟。各个公司推出了各种高保真和高效率的聚合酶及成套的 PCR 试剂盒，使得 PCR 技术简便而且有效。

1. 方法的选择：对于两端序列已知的情况，可根据两端序列设计引物，选用普通的 PCR 方法。对于只知道一端序列的情况，可使用（rapidly amplication cDNA ends）技术，RACE 分为 3\' 和 5\' 两种（Gibco 公司），也有两端 N 时逬行扩增的 RACE（Clontech 公司）。

2. PCR 扩增的模板：PCR 扩增的模板通常是指由 mRNA 逆转录而来 cDNA 第一链。PCR 模板量的多少直接影响到扩增的结果。在逆转录过程中，通常会加入一些接头（univursaladaptor）， 以便进行 PCR 的单引物扩增（锚定 PCR）。

3. PCR 扩增的特异性：决定 PCR 扩增特异性的因素很多，但通常有以下几点：

3.1 一股认为 PCR 反应所需的 mRNA 模板以仅为 1 ug。增加模板量可以提高扩增效率，但同时也使非特异产物增加。

3.2 PCR 中所使用的 Taq 酶通常有错配现象，出现频率约为 0.2％～0.5％。所以可以使用一些具有3\'-5\' 外切酶活性的高保真聚合酶，如 Pfu 酶、Vent 酶（Biolab）及 Pyrobcst 酶（Takara）等。

3.3 通常认为增加退火温度及减低 Mg2＋浓度可以提高扩增的特异性。

3.4 在 PCR 体系的操作中，将模板最后加入体系中及热启动等方法可以提高扩增的特异性。

4. 扩增产物：对产物可以采用酶切或 Northen 和 Dot 的杂交鉴定，并结合扩增片段的大小来确定是否为目的 cDNA。

1. cDNA 片段与载体进行联接反应（多在 4℃下进行低温联接）；

2. 使用两次 CaCl2 沉淀法制成的感受态细菌（如 DH5a 或 Jm 109 等菌株），进行转化；

3. 结合载体抗生素抗性特点，进行菌落的蓝白斑筛选；

4. 单个菌落的扩增培养及质粒的提取，酶切鉴定；

5. 阳性质粒的纯化及序列测定；

6. cDNA 序列的测定：现在多使用核酸自动测序仪来进行序列的测定。使用仪器多为 PE 公司的 337 型自动测序仪。这种仪器一个反应可以读出约 700 bp 长的核酸序列，正确率在 90％ 以上， 一个反应的成本约在 100 元（人民币）左右。由专业人员进行的测序一般可以保证正确率达到 95％ 以但要完全正确的读出序列。则需通读双链，并进行技术性分析及纠错才可得到。一般认为，在技术完善的情况下，影响测序的因素主要适 cDNA 本身的结构，如 G 和 C 含量过高，序列的一端有 polyT 结构等。

1. 首先是对所得 cDNA 进行同源性的比较。通常是在 NCBl 的 GenBank 数据库中来完成，利用 Blast 程序，比较其与已知基因的同源性。

2. 判断是否为完整的 cDNA 序列：如有无 polyA，有无起始和终止密码寻找开放性阅读框架（ORF，open reading frame）等。

3. 在上述分析完成后，我们便可以根据已确定的阅读框架将核苷酸序列翻译成氨基酸序列。现在各种工具软件很多，常用的如 DNAsis 及 GoldKey 等。在 GenBank 及 Swissprot 的网站上也可进行类似的工作，它们可以按照 3\' 和 5\' 两个方向提供六种阅读框架的翻译结果。可从其中根据所确定的框架作常方便的任选其一。